Laboratory of Stem Cell and Developmental Biology

 

도정태

건국대학교 동물생명과학대학 동물생명공학과

[연구실 소개]

저희 줄기세포발생학 연구실은 “생명탄생의 비밀을 밝힌다”는 모토아래 생명체의 생성 과정에서 일어나는 변화를 줄기세포를 이용하여 연구하고 있다. 특히 만능줄기세포(pluripotent stem cells)를 이용한 분화 및 발생기전 연구와, 분화된 세포에서 만능줄기세포를 유도하는 세포 리프로그래밍(cellular reprogramming, 역분화)에 관한 연구를 중점적으로 수행하고 있다. 줄기세포발생학 연구실을 지도하고 있는 도정태 교수는 1998년 핵치환 연구를 시작으로 세포융합에 의한 역분화, 유도만능줄기세포 등 만능성 유도 역분화 연구를 16년 동안 계속하고 있다. 따라서, 줄기세포 및 리프로그래밍 연구에 있어 탄탄한 기초가 다져져 있는 연구실이라고 자부한다. 만능줄기세포는 매우 매력적인 세포로써, 무한 증식이 가능하며, 원하는 모든 세포로 분화가 가능한 세포이다. 따라서, 난치질환에 의한 재생이 되지 않는 신체 조직을 대체할 수 있는 세포 치료재로써의 가치를 가지고 있어 난치성 질환 치료의 미래의학으로 각광받고 있다. 현재, 본 연구실에서는 난치질환 환자세포를 이용한 리프로그래밍에 의한 환자 유도만능줄기세포를 생산하고, 이를 이용하여 질병의 발병원인 및 질환의 기본 매카니즘을 규명하고자 하는 연구 또한 진행 중에 있다. 매카니즘에서 중요한 분야가 후생유전학적 기전연구라고 할 수 있다. 즉, 후생유전의 변화에 의해 또는 인위적인 후생유전의 변화를 유도해 새로운 형태의 세포를 만드는 것이 가능하다. 후생유전학은 가장 많이 알려져 있는 DNA 메틸화와 히스톤의 변화 등을 말하며, 이 두 가지 변화에 의한 유전자 발현 및 염색체의 변화 연구를 하고 있다. 우리 연구실은 연구원들이 언제나 자유롭게 의견을 나누고 교감할 수 있는 ‘열려 있는 연구실’을 지향하고 있다. 또한, 연구자에게 성과 부담감을 최소화하여, 결과물에 대한 압박에 의한 데이터 조작이 없는 정직한 연구실이다.

21세기는 생명공학의 시대라고 했다. 조금씩 생명공학의 시대가 다가오고 있으며, 21세기 중반이 되면 생명공학의 화려한 시대가 올 것이다. 앞으로 다가올 생명공학 시대의 개막을 줄기세포 분야가 선도하게 될 것이라 확신하고 있으며, 줄기세포발생학연구실이 함께 할 수 있도록 열심히 연구하는 연구실이 될 것이다.

[연구내용]

1. 안전한 유도만능줄기세포(iPS cells) 생산 방법 개발

초기 유도만능줄기세포 생산 방법은 바이러스를 이용한 역분화 인자의 과발현을 유도하는 것이다. 하지만, 바이러스를 이용할 경우 바이러스 유래 유전자가 세포에 삽입되어 유전자의 변화가 생긴다. 따라서, 본 연구실에서는 단백질 또는 플라스미드를 이용한 유전자 내 외래유전자 삽입 없는 역분화 방법을 개발하였다. 나노튜브(nanotube)는 지름 50 나노미터 길이 1 마이크로미터의 나노단위의 빨대 모양의 미세관이다 (그림 1). 이 나노튜브에 역분화 유도에 필요한 단백질, Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog를 붙여 세포와 배양하면, 역분화 단백질이 결합된 나노튜브는 세포 내로 들어가고, 역분화 단백질은 세포 내에서 역분화를 유도한다. 이렇게 하여, 역분화 마커인 Oct4-GFP 발현을 확인하였다. 그러나, 이 방법으로는 세포주를 수립할 수 없었다. 따라서, 다음 실험에서는 플라스미드를 일시적으로 transfection하여 역분화시키는 방법을 실시하였다 (그림 2). 플라스미드를 transfection하기 위해 또 다른 나노캐리어를 사용하였는데, 이것이 Xfect라고 하는 나노파티클(nanoparticle)이다. 이 방법에 의해서 성공적으로 유도만능줄기세포주를 수립할 수 있었다. 또한 reprogrammable 생쥐를 이용하여 체내에서 유발된 테라토마에서 유도만능줄기세포를 생산하는 기술을 개발하였다 (그림 3). 이 방법은 역분화 인자 유전자들이 발현이 독시사이클린에 의해 조절되는 세포로부터 만들어진 생쥐를 이용하는 방법이다. 타 연구기관에서 이렇게 수립된 유도만능줄기세포는 기존의 유도만능줄기세포보다 분화 능력이 뛰어나다고 말하고 있어 비교 분석하고 있다.

그림 1. 단백질과 나노튜브를 이용한 체세포 리프로그래밍 (Molecular Reproduction and Development. 2013. 80(12):1000-1008)

그림2. 플라스미드와 나토파티클을 이용한 체세포 리프로그래밍 (Stem Cells and Dev 2014, 23(21):2637-2648)

그림3. In vivo iPS 세포 생산 (특허출원-국내(10-2013-0140513))

2. 환자 유도만능줄기세포를 이용한 질병 연구

환자 유도만능줄기세포를 이용하여 사람에서 채취할 수 없는 세포 조직을 체외에서 만들어 이를 가지고 연구가 가능하다. 이런 연구의 일환으로 프래더윌리 환자의 피부세포를 이용하여 유도만능줄기세포를 생산하였다 (그림 4). 프래더윌리 환자 샘플은 SNURF-SNRPN 부위의 소실 또는 기타 이상으로 유발되는 신경질환이다. 따라서, SNURF-SNRPN 부위의 DNA 메틸화 정보를 분석하여 질병 근본 원인을 연구하고 있다. 프래더윌리 증후군은 신경질환으로써, 추후 신경세포로 분화 후 신경세포의 특징을 살펴봄으로써 질환의 발병 원인 및 기전을 연구할 수 있다.

본 연구실에서는 환자 유도만능줄기세포는 후생유전과 연관된 질환을 타겟으로 연구하고 있다. MeCP2(methyl cytocine binding protein 2) 이상에 의한 레트 증후군 환자 유도만능줄기세포를 이용한 연구도 같이 진행하고 있다. 이처럼, DNA 메틸화, 각인 유전자와 연관된 질환을 연구함으로써 후생유전 이상에 의한 질환을 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하고 있다.

그림 4. 플라스미드를 이용하여 생산된 인간 유도만능줄기세포

3. 리프로그래밍 및 분화 과정에서의 후생유전학적 연구

후생유전학 연구에 중요한 도구로 처녀생식 유도만능줄기세포를 이용하였다. 처녀생식 세포는 일반 세포와 달리 부계에서 받은 유전정보가 없이 모계(난자)의 유전정보만을 가지고 있는 비정상 세포이다. 즉, 비정상적인 DNA 메틸화와 비정상적인 각인유전 패턴을 가지고 있는 세포이다. 처녀생식 신경줄기세포를 10.5 dpc 배아에서 추출하여 수립하였다 (그림 5). 처녀생식 신경줄기세포는 부계 유전자가 없으므로 오직 모계 각인 양상을 보이므로 부계 각인 유전자는 메틸화가 되어 있지 않고, 모계각인 유전자는 완전히(100%) 메틸화가 되어있다. 이러한 처녀생식 각인 패턴이 역분화 되면서 DNA 메틸화 패턴이 바뀌는 것을 발견하였다. 완전 비메틸화되어 있던 H19, Igf2는 메틸화가 진행이 되고, Peg1, Peg3, Igf2r은 탈 메틸화가 진행이 된다. 더 특이적인 것은, 프래더윌리 증후군 관련 각인 유전자 Snrpn, Ndn은 거의 정상에 가깝게 변화하였다 (그림 5). 역분화되어 만능줄기세포가 된 후, 이 세포가 다시 신경줄기세포가 되면서 변화했던 각인 유전자 패턴이 그대로 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 비정상적인 각인유전자 패턴을 역분화와 분화과정을 거쳐 변화를 유도하여 정상화 시킬 수 있음을 시사하고 있다. 더욱이, Snrpn, Ndn의 DNA 메틸화 변화가 유도 되면서, 유전자 발현 또한 변화하여 정상의 발현 상태로 변하는 것을 확인하였다.

그림 5. 처녀생식 iPS 세포에서 분화된 신경줄기세포(miPS-NSC), 처녀생식 신경줄기세포, 정상 신경줄기세포의 각인 유전자 DNA 메틸화 패턴 비교 (J Cell Science. 2013. 126(11):2516-2524; Stem Cells. 2009. 27:2962-2968).

4. 신경줄기세포 분화 기술 개발

만능줄기세포는 크게 두 분류로 나뉜다. 완전만능줄기세포(naive pluripotent stem cells)와 준만능줄기세포(primed pluripotent stem cells)로 나뉘는데 모두 체외에서 분화하여 몸을 구성하는 모든 조직세포로 분화가 가능하지만, 준만능줄기세포는 배반포에 주입 후 체내 발달능이 없어 키메라를 형성하지 못하는 큰 차이를 보인다. 이러한 이유로, 두 만능줄기세포는 배양액 조성 및 분화 조건 또한 다르다. 본 실험실에서는 준만능성 세포인 EpiSC을 이용한 최초의 신경줄기세포로의 분화 기술을 개발하였다. 6.5 dpc epiblast에서 수립된 EpiSC은 테라토마를 형성하는 만능성을 지니고 있다 (그림 6). 이 EpiSC을 이용하여 bFGF 첨가 배지에서 신경줄기세포로 분화를 유도할 수 있었다. EpiSC 유래 신경줄기세포는 뇌세포 유래 신경줄기세포와 비슷한 양상을 보이고 있다. 이는 준만능줄기세포에서의 최초로 신경줄기세포로의 분화 성공 사례이다.

그림 6. EpiSC의 수립과 이를 이용한 신경줄기세포 분화 (Stem Cell Research. 2014. 12(2):506-516; 특허출원-국내(10-2013-0027388))

5. 체내 신경줄기세포 분화 방법

만능줄기세포를 생쥐의 피하(subcutaneous) 또는 testis capsule에 주입하면 테라토마(teratoma) 형성하는데, 이 테라토마는 만능세포로부터 증식 및 분화된 세포로 형성된 종양의 일종으로 내배엽, 중배엽, 외배엽 조직을 모두 포함하고 있다. 이 테라토마에 존재하고 있는 만능줄기세포 유래의 여러 조직세포 중에서 신경줄기세포를 추출하여 체내 신경줄기세포를 생산하는 방법을 개발하였다. 이렇게 수립된 만능줄기세포로부터 만들어진 테라토마 유래 신경줄기세포는 신경줄기세포 마커(Nestin, Musashi)를 발현하며, 정상적으로 neuron, astrocyte, oligodendrocyte로의 분화가 가능하다 (그림 7). 이 연구는 체내에서 형성된 신경줄기세포를 배양하는 새로운 만능줄기세포 분화 기술이다.

그림 7. 만능줄기세포를 이용한 체내 신경줄기세포 분화 시스템. 테라토마에서 형성된 신경줄기세포의 추출 및 배양. 특허출원-국내(10-2014-0026318), 특허출원-국내 (10-2014-0026317)

6. X 염색체 활성화 연구

만능줄기세포와의 세포 융합에 의한 역분화는 매우 강력한 역분화 방법이다. 즉 배아줄기세포와 체세포를 융합하면, 체세포는 1-2일 안에 만능성을 획득하게 된다. 만능성 획득하면서 일어나는 변화 중 하나가 X chromosome reactivation(X 염색체 재활성화)이다. 자성 체세포는 두 개의 X 염색체를 포함하고 있는데, 두 개의 X 염색체 중 하나는 불활성화되어 있다. 이러한 형상을 “X 염색체 불활성화(X chromosome inactivation)”라고 하며 불활성화된 X 염색체를 “불활성 X 염색체(inactive X chromosome)”라고 한다. 이 불활성 X 염색체에 존재하는 대부분의 유전자들은 발현하지 않는 상태로 평생 지속된다. 하지만, 이 불활성 X 염색체가 역분화되어 만능성을 획득하면 활성화가 일어난다. 불활성 X 염색체에 GFP 마커가 삽입된 형질전환 체세포를 배아줄기세포와 융합시켜 만능성세포로 만들었다. 이러한 X-GFP 시스템을 이용하여 불활성 X 염색체에 있는 GFP가 활성화되어 발현하게 되면 불활성 X 염색체가 활성화 되었음을 알 수 있다 (그림 8). 만능융합세포가 되어 활성화된 X 염색체는 분화되면 다시 불활성화되는데, 이 과정에서 이전에 불활성화 X 염색체(GFP 유전자를 포함하고 있는)였던 X 염색체가 다시 선택이 되는 것이 아니라 무작위적으로 선택이 일어남을 증명하였다 (그림 8). 즉, X 염색체가 활성화되면서 기존의 불활성화 상태의 기억을 완전히 지워버린다는 것을 의미한다.

그림 8. 세포 융합에 의한 역분화 과정에서 X염색체 불활성 및 활성화

불활성 X염색체 관련 non-coding RNA인 Xist(X inactivation specific transcript)는 X 염색체 불활성에 있어 매우 중요하게 작용한다. Xist는 두 가지 isoform이 존재하는데 L-isoform과 S-isoform이다. 특이하게 S-isoform은 female cell에서만 발현한다. 이러한 패턴이 역분화 과정에서도 그대로 일어남을 발견하였다. 즉, post-transcription event 역시 역분화 과정에서 그대로 일어나고 있음을 보여주고 있다 (그림 9).

그림 9. 불활성 X염색체 관련 non-coding RNA Xist의 두 가지 isoform 및 성별에 따른 alternative splicing의 차이 (J Cell Science. 2014. In press)

7. 다양한 동물에서의 유도만능줄기세포 생산

최근에 여러 가축에서의 유도만능줄기세포를 생산하는 실험을 하고 있다. 닭, 돼지 등의 가축의 체세포를 이용한 유도만능줄기세포를 생산하여, 아직까지 줄기세포의 수립이 어렵고 연구가 미비한 가축에서의 연구를 가능하도록 노력하고 있다. 또한, 가축의 질환 모델을 수립하는 기술을 개발하여 농축산 산업에도 이바지하고자 노력하고 있다.

그림 10. 닭 만능세포인 blastoderm cell과 닭 유도만능줄기세포

[연구책임자]

성명: 도정태
주소: 서울시 광진구 능동로 120 건국대학교 동물생명과학관 418호
전화: 02-450-3673
팩스: 02-455-1044
E-mail: dojt@konkuk.ac.kr
Homepage: http://www.stemism.com, http://www.stemism.ac.kr

[연구진구성]

교수: 도정태
박사후 연구원: 김종수
연구원: 최솔
박사과정: 최현우
석사과정: 홍연주, 장현식, 서봉종

[대표논문]

1. Joo JY, Choi HW, Kim MJ, Zaehres H, Tapia N, Stehling M, Jung KS, Do JT, Scholer HR. (2014) Establishment of a primed epiblast stem cell in FGF4-based conditions. Scientific Reports. In press.
2. Kim JS, Choi HW, Choi S, Arauzo-Bravo MJ, Hans R. Scholer, Do JT. (2014). Reactivation of inactive X chromosome and post-transcriptional reprogramming of Xist in induced pluripotent stem cells. Journal of Cell Science. doi:10.1242/jcs.154294.
3. Choi HW, Kim JS, Choi S, Hong YJ, Kim MJ, Seo HG, Do JT. (2014) Neural stem cells differentiated from iPS cells spontaneously regain pluripotency. Stem Cells. 32(10):2596-2604
4. Kim JS, Choi HW, Choi S, Seo HG, Moon SH, Chung HM, Do JT. (2014) Conversion of partially reprogrammed cells to fully pluripotent stem cells is associated with further activation of stem cell maintenance and gamete generation-related genes. Stem Cells and Development. 23(21):2637-2648.
5. Jang HJ, Kim JS, Choi HW, Jeon I, Choi S, Kim MJ, Song J, Do JT. (2014) Neural stem cells derived from epiblast stem cells display distinctive properties. Stem Cell Research. 12(2):506-516
6. Kim MJ, Choi HW, Jang HJ, Chung HM, Arauzo-Bravo MJ, Scholer HR, Do JT. (2013) Conversion of genomic imprinting by reprogramming and redifferentiation. Journal of Cell Science. 126(11):2516-2524.
7. Cho SJ, Choi HW, Cho J, Jung S, Seo HG, Do JT. (2013) Activation of pluripotency genes by a nanotube-mediated protein delivery system. Molecular Reproduction and Development. 80(12): 1000-1008.
8. Choi HW, Kim JS, Jang HJ, Choi S, Scholer HR, Do JT. (2012) Reestablishment of the inactive X chromosome to the ground state through cell fusion-induced reprogramming. Cellular and Molecular Life Science 69(23):4067-4077
9. Choi HW, Kim JS, Choi S, Jang HJ, Kim MJ, Choi Y, Scholer HR, Chung HM, Do JT. (2011) Neural stem cells achieve and maintain pluripotency without feeder cells. PLoS One 6(6):e21367
10. Do JT, Choi HW, Choi YS, Scholer HR. (2011) Pluripotent hybrid cells contribute to extraembryonic as well as embryonic tissues. Stem Cells Dev. 20:1063-1069.
11. Do JT, Joo JY, Han DW, Arauzo-Bravo MJ, Kim MJ, Greber B, Zaehres H, Sobek-Klocke I, Chung HM, Scholer HR. (2009) Generation of parthenogenetic iPS cells from parthenogenetic neural stem cells. Stem Cells. 27:2962-2968
12. Do JT, Han DW, Gentile L, Sobek-Klocke I, Wutz Anton, Scholer HR. (2009) Reprogramming of Xist againt the pluripotent state in fusion hybrids. Journal of Cell Science.122:4122-4129
13. Do JT and Scholer HR. (2009) Regulatory circuits underlying pluripotency and reprogramming. Trends in Pharmachological Science. 30:296-302.